MALDI-TOF（Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight）是一種基于飛行時(shí)間測(cè)量的質(zhì)譜技術(shù)，在微生物學(xué)中，MALDI-TOF通過(guò)識(shí)別物種水平的細(xì)菌來(lái)幫助檢測(cè)病原體和分析微生物。然而，MALDI-TOF需要嚴(yán)格的樣品處理方法，以確保MS數(shù)據(jù)中細(xì)菌細(xì)胞的可重復(fù)性。

盡管MALDI-TOF可以通過(guò)其蛋白質(zhì)識(shí)別細(xì)菌種類，但生成用于細(xì)菌鑒定的可重復(fù)性MS數(shù)據(jù)需要許多步驟，這些步驟中的變量，例如樣品制備方法、獲得的細(xì)菌菌落量和菌落的年齡，都會(huì)影響MS數(shù)據(jù)的質(zhì)量，由于MALDI-TOF中存在許多實(shí)驗(yàn)變異源，研究人員越來(lái)越多地尋求自動(dòng)化方法，以盡量減少技術(shù)錯(cuò)誤。

自動(dòng)化 /PIXL

在MALDI-TOF樣品制備流程中引入自動(dòng)化可以減少了人為錯(cuò)誤，提高了可重復(fù)性，并提高了研究人員的效率，對(duì)于MALDI-TOF MS工作流程，自動(dòng)化樣品處理和物種鑒定方案可以使物種水平的鑒定更具可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，使用 PIXL 高通量菌落挑選工作站可以更快更有效地完成實(shí)驗(yàn)。

圖1.PIXL菌落提取機(jī)器人 [左] 及其內(nèi)部組件 [上圖]，用于MALDI-TOF樣品處理的自動(dòng)化系統(tǒng)

- 自動(dòng)化解決方案 -

對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、烏達(dá)纖維素單胞菌和產(chǎn)堿假單胞菌的自動(dòng)化制備方法進(jìn)行了測(cè)試， 在自動(dòng)化流程中，使用 PIXL 高通量菌落挑選工作站 （Singer Instruments） 從培養(yǎng)樣品中挑選菌落并接種到一次性 MALDI MS 樣品板上，例如 FlexiMass-DS 載玻片，將自動(dòng)化方案與手動(dòng)制備進(jìn)行比較，在手動(dòng)制備中，用接種環(huán)點(diǎn)樣，通過(guò)確定自動(dòng)化流程，確定使用點(diǎn)種法還是涂片法

采用兩種自動(dòng)細(xì)菌轉(zhuǎn)移方法。點(diǎn)種法（最左邊）將挑取的樣品“輕點(diǎn)”到目標(biāo)表面上的一個(gè)點(diǎn)上，而涂片法（左）則在目標(biāo)表面上涂抹，形成菌膜.

為了進(jìn)一步評(píng)估自動(dòng)化流程，還為每種細(xì)菌物種挑選了培養(yǎng)板的不同區(qū)域.

圖3.細(xì)菌被挑選的三個(gè)區(qū)域。綠色是指培養(yǎng)物生長(zhǎng)的最厚部分，或“深”。粉紅色代表劃線培養(yǎng)的“邊緣”。黃色是指從劃線培養(yǎng)生長(zhǎng)最厚的部分挑?。▽?shí)心箭頭，1），然后涂抹在不含任何培養(yǎng)物的瓊脂區(qū)域，以去除多余的物質(zhì)，接種到MALDI靶標(biāo)上（虛線箭頭，2）

制備樣品后，在iDplus Performance MALDI-TOF質(zhì)譜儀上分析點(diǎn)種和涂片，并提交至SARAMIS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。

PIXL /結(jié)果

為了評(píng)估MALDI-TOF的自動(dòng)采樣方法，研究人員對(duì)培養(yǎng)板上的三種類型的菌落進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，基質(zhì)溶液的自動(dòng)涂片和自動(dòng)單/雙點(diǎn)種在鑒定大腸桿菌方面同樣準(zhǔn)確，置信度為 >99.9%（圖 4），相比之下，手動(dòng)方法的弊端就是引入了增塑劑和其他污染物，這些污染物混淆了用于識(shí)別微生物種類的m/z峰。

開(kāi)發(fā)自動(dòng)化方案，要確定自動(dòng)樣本采集是否可以高置信度地識(shí)別其他三種細(xì)菌物種。自動(dòng)化方案允許鑒定其中兩個(gè)物種，枯草芽孢桿菌、烏達(dá)纖維素單胞菌，置信度超過(guò)99.9%，雖然枯草芽孢桿菌鑒定有紅色 ID，這是由于數(shù)據(jù)庫(kù)中的是混合 ID，而不是自動(dòng)采樣方法本身，因此，PIXL自動(dòng)化和手動(dòng)方法的數(shù)據(jù)是最有效的，枯草芽孢桿菌的 MALDI-TOF MS 譜圖幾乎相同。

圖使用自動(dòng)涂片管道制備的大腸桿菌樣品的鑒定結(jié)果，用于從培養(yǎng)板的所有區(qū)域采集的樣品。深綠色 = >99.9% 置信度，淺綠色 = 90.0 – 99.8% 置信度，紅色 = 混合 ID，白色 = 無(wú) ID

使用優(yōu)化的自動(dòng)化方法時(shí)，枯草芽孢桿菌、烏達(dá)梭菌和凝聚假單胞菌的物種鑒定結(jié)果。深綠色 = >99.9%置信度，淺綠色 = 90.0 – 99.8%置信度，紅色 = 混合 ID

具有代表性的 MALDI-TOF MS 譜圖，用于使用手動(dòng)制備的涂片樣品（紅色）和使用自動(dòng)方案制備的涂片樣品（藍(lán)色）

PIXL /結(jié)論

將自動(dòng)化集成到研究流程中，可以簡(jiǎn)化研究方案，并提高生物醫(yī)學(xué)研究的可重復(fù)性，在微生物學(xué)中，自動(dòng)化也可用于MALDI-TOF鑒定微生物物種，自動(dòng)化可以促進(jìn)樣品收集和涂片，這兩者都會(huì)影響基于MALDI-TOF MS的細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

使用PIXL自動(dòng)進(jìn)行菌落挑取和基質(zhì)沉淀，可以準(zhǔn)確并重復(fù)地鑒定微生物物種，此外，自動(dòng)菌落挑取方法生成的MALDI-TOF MS譜圖與手動(dòng)方法產(chǎn)生的譜圖相似，因此自動(dòng)化樣本采集方案使MALDI-TOF鑒定更具可重復(fù)性。

借助自動(dòng)化MALDI-TOF MS流程，研究人員可以有效地對(duì)微生物進(jìn)行分型和表征，廣泛用于從病原體鑒定到抗生素敏感性測(cè)試。